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  目的基因的敲除采用同源重组的方法。本实验首先利用谷氨酰胺合成酶基因glnA上下游引物glnA-FW和glnA-RV扩增出glnA基因序列,大小为1335 bp。然后将其连接到pMD19-T质粒上,构建质粒pMD19T-glnA。同样的,利用引物NEO-FW和NEO-RV扩增出新霉素抗性基因Neo,并将其连接到pMD19-T载体上,构建质粒pMD19T-Neo。将质粒pMD19T-glnA和pMD19T-Neo均用NcoⅠ和PstⅠ酶进行双酶切,酶切后的新霉素片段连接到经同样酶切的pMD19T-glnA质粒上,构建敲除质粒pMD19T-glnA∷Neo。最后将敲除质粒pMD19T-glnA∷Neo转化进入枯草芽孢杆菌WB600中进行同源重组,在新霉素平板上筛选正确的转化子。

  青海发光杆菌将重组菌接种于20 mL LB液体培养基中,37℃、200 r/min过夜活化。按照初始OD600 0.1的添加量转接于30 mL LB液体培养基中,37℃、200 r/min培养36 h,期间每隔2 h取样1次测定菌体浓度,最后一次取样间隔为4 h。菌体浓度的测定以分光光度计600 nm波长下的吸光值OD600表示。OD600根据下列公式转化为细胞干重:1 OD =0.35 g/L DCW。

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